Wie wird die LAMBDA Peristaltikpumpe zur Fütterung von Nährstoffen während der Fedbatch-Fermentation gesteuert? Am Beispiel der Produktion der rekombinanten Xylose-Reduktase wird der Einsatz der angesteuerten LAMBDA PRECIFLOW Peristaltikpumpe für die exponentielle Fütterung während der Wachstums- und Produktionsphase im Fedbatch-Prozess aufgezeigt.
Exponentielle Fütterung in der E. coli Fedbatch-Fermentation für eine verbesserte Ausbeute von Xylose Reduktase (CtXR)
Die Forscher des Instituts für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik & technische Biowissenschaften der TU Wien (AT) suchten nach einer Xylose-Reduktase (XR), die auch bei erhöhten Temperaturen eine gute Enzymaktivität aufweist. Hierzu bauten die Forscher das aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum (Ct) isolierte Gen in das Bakterium Escherichia coli ein und stellten in der Fedbatch-Fermentation ausreichend rekombinante Xylose-Reduktase (CtXR) her, um anschliessend das Enzym aufzureinigen und zu charakterisieren:
Abb. 1: Um 360 U/L Xylose-Reduktase (CtXR) aufzureinigen und zu charakterisieren, wurde in der E. coli Fedbatch Fermentation eine exponentielle Fütterungsstrategie verwendet. Quehenberger J, Reichenbach T, Baumann N, Rettenbacher L, Divne C, Spadiut O. Kinetics and Predicted Structure of a Novel Xylose Reductase from Chaetomium thermophilum. Int J Mol Sci. 2019 Jan 6;20(1):185. doi: 10.3390/ijms20010185. PMID: 30621365; PMCID: PMC6337131.
Für die gesteuerte exponentielle Fütterungsstrategie während der Wachstums- und induzierten Produktionsphase im Fedbatch-Verfahren kam die präzise LAMBDA PRECIFLOW Peristaltikpumpe zum Einsatz.
Von welchem Interesse sind Xylose-Reduktasen?
Xylose-Reduktasen (XR) sind Enzyme, die Xylose in Xylit umwandeln. XR ermöglicht beispielsweise der Hefe die Nutzung von Hemicellulose, um Ethanol zu produzieren. Die Xylose-Reduktasen werden auch als Biokatalysatoren eingesetzt, um Xylit für die Pharma- und Lebensmittelindustrie zu gewinnen.
E. coli Fedbatch-Fermentation mit gesteuerter exponentieller Fütterung
Die wissenschaftliche Veröffentlichung doi.org/10.3390/ijms20010185 beschreibt die E. coli Fedbatch-Fermentation mit hoher Zelldichte zur Gewinnung von CtXR:
Nach der Inokulation startete die E. coli Flüssigkultur als Batch mit 5 Liter Arbeitsvolumen. Anschliessend wurde LAMBDA PRECIFLOW als Fütterungspumpe für die gesteuerte exponentielle Fütterung im Fedbatch-Verfahren (5 L – 8 L Arbeitsvolumen) eingesetzt:
- 14 h Wachstumsphase (μ = 0.1 h−1) bis zum Trockenzellgewicht (DCW) von 35 g/L,
- gefolgt von der mit IPTG induzierten Produktionsphase (μ = 0.04 h−1).
Nach der 34-stündigen Fermentation wurden 230 g/L Biomasse mit 62 g/L Trockenzellgewicht abgeerntet, wobei eine Ausbeute mit einem Titer von 360 U/L bzw. 5.8 U/g Trockenzellgewicht erzielt wurde.
Die Fermentation in dieser Studie hatte wie die meisten industriellen Fedbatch-Fermentationen eine hohe Zelldichte zum Ziel, um im begrenzten Reaktorvolumen in möglichst kurzer Zeit, die gewünschte Ausbeute zu erzielen. Um ohne Substratlimitierung rasch die gewünschte Lebendzellzahl für die Produktion zu erreichen, wurde bereits in der Wachstumsphase ein exponentielles Feed-Profil gewählt.
Die Forscher erwähnten in ihrer Veröffentlichung, das Zulaufverfahren mit einer Störgrössenaufschaltung gesteuert zu haben.
Welche Fütterungsstrategien werden im Allgemeinen für Fedbatch-Verfahren eingesetzt?
Während Fedbatch-Fermentationsprozessen (Zulaufverfahren) werden allmählich ein oder mehrere Nährstoffe der Zellbrühe zugefügt, ohne dabei Medium und/oder Zellen aus dem Fermenter abzuernten, wodurch das Arbeitsvolumen im Verlauf der Fermentation steigt.
Zu den gängigen Fütterungsstrategien für Fedbatch-Verfahren gehören die diskontinuierliche Fütterung durch Substratimpulse, die regelmässige kontinuierliche Fütterung nach einem vorgelegtem Feed-Profil und die geregelte kontinuierliche Fütterung basierend auf einer Rückkoppelung von inline gemessenen Variablen (z.B. pO2), die mit dem Zellwachstum / Stoffwechsel zusammenhängen.
Im Weiteren werden konstante, lineare oder exponentiell ansteigende bzw. modifizierte exponentielle Fütterungsraten unterschieden.
Peristaltikpumpen für die präzise und genaue Dosierung im Zulaufverfahren
Unabhängig von der Fütterungsstrategie ist eine präzise und genaue Dosierung der Nährstoffe im Zulaufverfahren äusserst vorteilhaft:
In der wissenschaftlichen Veröffentlichung doi.org/10.3390/ijms20010185 der TU Wien wurde zur gesteuerten exponentiellen Fütterung die eigens für Fermentationen entwickelte LAMBDA PRECIFLOW Peristaltikpumpe eingesetzt.
Tatsächlich arbeiten auch die meisten Fedbatch-Fermentationen zur Entwicklung von industriellen Anwendungen im Labor vorzugsweise mit schnell wachsenden Stämmen wie E. coli und werden mit der gängigen sterilen hochkonzentrierten Glukoselösung als sogenannten C-Feed (C für Kohlenstoff) gefüttert. LAMBDA Peristaltikpumpen bieten hierzu nebst einer präzisen und genauen Dosierung auch analoge / serielle Anschlüsse für die Ansteuerung sowie die Möglichkeit, einfach mit sterilen Silikonschläuchen bestückt zu werden.
Abb. 2: LAMBDA PRECIFLOW mit sterilem Silikonschlauch – eine analog/seriell ansteuerbare LAMBDA Peristaltikpumpen für die genaue und präzise Fütterung im Fedbatch-Verfahren.
Kompakte, programmierbare Pumpen für standardisierte Fed-Batch Fermentationen
Für Fermentationen mit standardisiertem Fütterungsprofil, sind programmierbare Pumpen eine kompakte Lösung.
Programmierbaren LAMBDA Peristaltikpumpen lassen den automatischen Start, die Förderdauer und Pumpgeschwindigkeit für jeden Programmschritt ganz einfach am Display vorgeben. Die programmierbaren LAMBDA MULTIFLOW, HiFLOW, MAXIFLOW und MEGAFLOW unterscheiden sich in ihren Durchsatzbereichen:
Abb. 3: Die programmierbaren LAMBDA MULTIFLOW, HiFLOW, MAXIFLOW und MEGAFLOW Pumpen (Angegebene Durchsätze unter Verwendung der Standardschläuche und Wasser bei 20 °C.)
Nebst der Geschwindigkeitseinstellung kann zusätzlich der Dosierbereich durch den Einsatz von Silikonschlauch mit einem kleineren Innendurchmesser verfeinert dem gewünschten Feed-Profil angepasst werden.
PC-Programme zur Ansteuerung von Dosiergeräten für Fedbatch-Fermentationen
Während eine konstante Fütterung meist direkt am Dosiergerät eingestellt wird, bieten bedienerfreundliche PC-Programme wie PNet eine einfache Handhabung der Feed-Profile für die Fedbatch-Fermentationen:
Vorlage von Feed-Profilen für Parallelfermentationen
Die PC-Software PNet ist besonders interessant für Feed-Profile in Parallelfermentationen, da PNet gleichzeitig bis zu sechs Dosiergeräte mit gleichen oder unterschiedlichen Feed-Profilen anzusteuern vermag.
In der technischen Mikrobiologie findet die gleichzeitige Ansteuerung mehrere Dosiergeräte z.B. in parallel geführten Use-Tests Anwendung (z.B. Eingangstests der neuen Medienkomponenten für die Produktion).
Fedbatch & Prozessoptimierung: Automationssoftware für die FedBatch-Fermentation
Komplexere Programme für die Laborautomation wie die PC-Software SIAM bieten nebst der Parameterregelung für die Fermentation auch Fütterungsstrategien mit Störgrössenaufschaltung, um z.B. einer Überfütterung während des aeroben Wachstums von Hefe oder E. coli vorzubeugen.
Für Fedbatch-Fermentationen bietet die Automationssoftware SIAM zudem den automatischen Start des vorgelegten Fütterungsprofils abhängig von einem Messwert, z.B. startet die Fütterung, sobald der Trübungsmesswert einen bestimmten Wert überschritten hat.
Weitere Informationen
Weitere Informationen zur Xylose-Reduktase, Peristaltikpumpen und Fedbatch-Anwendungen sowie PC-Software:
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